11月27日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所钟超课题组、周佳海课题组与深圳未知君谭验团队合作在Nature Chemical Biology上发表设计新型“活材料”的“IT+BT”新范式，题为Accelerating the design of pili-enabled living materials using an integrative technological workflow。该工作通过联合生物信息学、结构生物学和合成生物学的技术方法，实现了对合成特定生物聚合物菌株的高通量挖掘和筛选、生物聚合物组装机制的解析以及新型“活材料”的理性设计，搭建出快速开发新型“活材料”的“IT+BT”新范式（图1）。中科院深圳先进技术研究院黄园园助理研究员为本文第一作者，中科院深圳先进技术研究院钟超研究员、周佳海研究员和未知君的谭验博士为文章共同通讯作者。另外深圳先进技术研究院的科研助理吴彦霏和博士生王杰，深圳未知君的胡函博士和童邦卓工程师，深圳先进技术研究院李楠研究员团队，上海蛋白质中心的彭超研究员和殷跃以及钟超研究员团队的其他同学也对该工作也做出了重要贡献。 

　　工程“活材料”（ELMs），是合成生物学与材料科学领域交叉发展衍生出的新兴领域。自组装的活体功能材料是当前”活材料”的重要组成部分，它由细胞和其自编程的生物聚合物共同组成。自组装的活体功能材料具有自生长、自适应、可进化等“活”的生命属性，并在生物传感、生物修复、疾病治疗和智能材料制备等领域表现出广阔的发展前景。然而，在当前自组装的活体功能材料的开发中，具有可编程生物聚合物基元的底盘细胞匮乏，使构筑具有更多功能且能满足不同应用场景的微生物“活材料”受限，并成为阻碍ELMs领域进一步发展的重要因素。 

　　为了解决上述瓶颈，首先钟超研究团队与深圳未知君谭验博士团队合作开发出了软件BBSniffer（图2），用于挖掘自然界中具有合成特定生物聚合物菌株，并为用户推荐出可用于下一步工程新型“活材料”的底盘细胞。用户仅需在软件中输入感兴趣的生物聚合物(包括蛋白质、多糖和其他生物聚合物)相关的专业术语，BBSniffer就可以从庞大的细菌基因组数据库中，搜索出合成相关生物聚合物基因簇的所有菌株，并通过软件内置的细菌分类数据库对菌株进行致病菌、工业菌株和其它菌株的分类及打分后，便可为用户生成用于下一步工程新型“活材料”的候选菌株参考列表。 

　　研究团队以“共价交联型菌毛”作为示例，对自然界中合成此类蛋白质纤维的菌株进行筛选和分类后，挖掘出102株工业菌株中具有合成共价交联行菌毛的基因簇；通过对挖掘到的工业菌株进行进化树分析后，生成相对于参考菌株（研究共价交联型菌毛中的模式菌株，致病菌白喉杆菌）的亲缘关系距离打分文件；根据距离打分文件， BBSniffer生成包含有候选菌株培养条件、是否可编辑等信息的打分列表。研究者根据BBSniffer生成的候选菌株列表，选取易培养且基因组可编辑的工业菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC14067，作为下一步开发基于共价交联型菌毛的新型微生物“活材料”的底盘细胞。 

　　新型生物聚合物的组装机制解析对其进一步的工程改造有着非常重要的意义。因此，研究者以BBSniffer推荐的工业菌株谷氨酸棒状杆菌作为研究对象，通过基因敲除和形貌表征的方法，揭示了BBSniffer挖掘出的谷氨酸棒状杆菌中共价交联型菌毛（Spa菌毛）是由次要蛋白Spa1，Spa2和骨架蛋白Spa2共同组成。然后通过质谱鉴定，揭示了分选酶催化Spa2单体间缩合，形成分子间的异肽键，实现骨架蛋白单体间的聚合。此外，通过联合质谱鉴定、X-ray晶体衍射技术和体内验证实验，揭示了Spa2蛋白单体内的三对分子内异肽键和二对二硫键在纤维形成中的重要作用。 

　　在对Spa菌毛纤维形成机制解析的基础上，研究者对Spa菌毛的骨架蛋白Spa2进行理性设计，构建出了基于Spa菌毛的新型可编程细胞外蛋白质支架（图3）。首先，研究者尝试将mCherry分别融合在Spa2的信号肽之后以及不含二硫键的M-domain的不同loop区域，结果表明这些位点都能够装载mCherry并可以形成纤维结构（图3a，b）；此外，通过在Spa2上装载不同类型/大小的功能性肽段/蛋白/酶，也能够在细胞外形成具有对应功能的纤维。 而后，研究者通过将Spa2单体同时融合分割的绿色荧光蛋白Venus的氨基端和羧基端，结果发现重组的细胞表面实现了荧光的互补，这表明可编程的Spa菌毛蛋白支架也可以用于细胞外多个蛋白的共组装（图3c-e）。 

　　以上的研究表明，可编程的Spa菌毛能够对多个蛋白共组装，有望应用于细胞外的酶促级联反应中。因此，研究者通过在骨架蛋白Spa2上融合多个纤维素酶，实现了在体外将粘稠的纤维素降解为细胞可以利用的葡萄糖；此外，通过工程工业菌株谷氨酸棒状使其具有生产番茄红素的能力（图4）。研究者通过结合工程细胞具备的细胞外降解纤维素为葡萄糖的能力，和细胞内具备的转化葡萄糖为高附加值化合物的能力，构筑出具有将废弃物转化为高附加值化合物的新型活体功能材料。 

　　综上所述，该研究通过利用IT技术，实现了对自然界中生产生物聚合物菌株的的挖掘、分类以及分析，可以快速为用户找到易工程的非致病菌株作为新型“活材料”构筑的底盘细胞；通过BT技术，实现对挖掘到的底盘细胞中生物聚合物机制的解析，推进可编程生物聚合物的设计，并实现新型“活材料”的快速构筑。该研究为新型“活材料”的开发提供了“IT+BT”的新范式，并将加速新型“活材料”的开发。 

　　该工作获得了国家重点研发计划、国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金、深圳市材料合成生物学重点实验和广东省基础与应用基础研究基金等项目的支持以及深圳市微生物药物智能制造重点实验室、深圳先进技术研究院与未知君共同创立的“BT-IT 材料创新”联合实验室(https://mp.weixin.qq.com/s/mnoA0-iZeDGMVi3Tjrh3Ig)、深圳合成生物学创新研究院和定量合成生物学重点实验室等平台的支持。感谢国家蛋白质科学研究设施(上海) BL19U1线站的工作人员在晶体衍射数据收集中的支持与帮助，同时也感谢武汉大学范成鹏老师对结构解析的指导与帮助。 

图1 开发新型“活材料”的“IT+BT”新范式

　　图2 BBSniffer从自然界中挖掘合成靶标生物聚合物底盘细胞的流程

图3 开发基于Spa菌毛的新型可编程的细胞外蛋白质支架

图4 构筑将废弃物转化为高附加值化合物的新型“活材料”

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